Etapa 2 – 2021

Alternative de obținere a compușilor naturali sau de sinteză, alegerea modelului funcțional și testarea acestora în procesele

implicate în radioterapie

În etapa a doua studiile cu privire la metodele de extracție și caracterizare a compușilor principali din turmeric și ghimbir au fost continuate de CO, utilizând metoda soxhlet, extracția în câmp de microunde și extracții asistate de procese de ultrasonare, în apă/solvent. Extractele naturale obținute au fost caracterizate pentru identificarea compușilor principali constituenți, prin cromatografie pe strat subțire, iar apoi compușii au fost separați prin

procedeul ˮflash chromatographyˮ. Fracțiile separate au fost analizate prin spectroscopie UV-Vis, iar împreună cu masa reziduală rezultată în urma

proceselor de extracție au fost caracterizate prin spectre FTIR și spectre de reflexie difuză.

Asemanător cu structurile compușilor naturali extrași din turmeric, respectiv ghimbir, au fost sintetizati o serie de compuși utilizând metoda clasică de sinteză în solvent sau metoda în câmp de microunde. Astfel, cromogeni bis-aril-1,6-heptadien-3,5-dionici au fost obținuți în câmp de microunde, iar compușii derivați curcuminici, 3,5-bis(stiril)pirazolonici au fost sintetizați prin metoda clasică. În paralel, derivații de 6-aril-5-hexen-2,4-dionă au fost sintetizați fără solvent, în câmp de microunde, prin reacția de condensare dintre benzaldehide substituite și acetilacetonă, apoi condensarea cu hexanal. Totodată structurile de tipul 6-aril-5-hexen-2-onei au fost obținute prin metoda clasică în solvent, în urma reacțiilor succesive de condensare dintre benzaldehide substituite, acetonă și hexanal. Compușii sintetizați au fost purificați prin metode specifice și caracterizați prin cromatografie pe strat subțire, spectroscopie FTIR, spectroscopie UV-Vis, RMN și analiză termogravimetrică.

Recent, în studii de specialitate a fost raportat că nanoparticulele de seleniu (SeNP) pot induce apoptoza celulelor tumorale prin declanșarea căii de transducție a semnalului de apoptoză. Cu toate acestea, aplicarea SeNP-urilor ca agent antitumoral are unele probleme urgente de rezolvat, cum ar fi stabilitatea slabă și biodisponibilitate scăzută, care împiedică aplicarea sa medicală. Din acest motiv am considerat de interes și ca noutate încercarea de a obține prin metode deja cunoscute în literatură, nanoparticule de seleniu, în prezența extractului de ghimbir, cu scopul de a obține un nanocompozit cu efect sinergic al celor două componente. Pentru aceasta au fost obținute două tipuri de extracte – apos, respectiv alcoolic de ghimbir, care au reprezentat în continuare mediul de generare al nanoparticulelor de seleniu, la un raport masic, volum de extract: biselenit de sodiu 1:0.002; 1:0.004; 1:0.008. Astfel, extractul de ghimbir a fost folosit ca mediu reducător, cele două tipuri de extracte fiind diferite prin conținutul de polifenoli și polizaharide care au fost studiate în etapa anterioară. Nanocompozitele rezultate în extract alcoolic (G317) și extract apos de ghimbir (G718) au fost caracterizate prin spectre UV-Vis, FTIR și DLS, apoi au fost testate pentru activitatea antimicrobiană și viabilitatea celulară. Partenerul UB urmărind concept design-ul stabilit în prima etapă a realizat testarea derivaților de curcumină și shogaol sintetizați de CO, folosind cele două modele celulare in vitro, pentru testele de biocompatibilitate, respectiv toxicitate. În paralel, pentru stabilirea tehnologiei de tratament, s-a realizat mai întai testarea efiecienței celulelor sângelui ca modele celulare pentru evaluarea proprietăților exercitate de derivații de curcumină. Metoda aleasă pentru determinarea activității enzimei glutation peroxidaza GPx se bazează pe monitorizarea formării GSSG (disulfură de glutation), care este redus continuu prin adăugarea unui exces de glutation reductază, generând un nivel constant de GSH (Glutation).

După alegerea metodei de testare, din lotul de compuși analizați pentru evaluarea biocompatibilității și citotoxicității si tinand cont de metodele bioinformatice de predictie cu privire la relatia structura-proprietati, au fost selectati doi compuși care au manifestat citotoxicitate foarte scăzută. Acești derivați beta-dicetonici cu structura stiril-pirazolonică și standardul de curcumină au fost supuși testelor efectuate prin expunere la radiații gamma (10 sau 50 Gy), cu privire la evaluarea proprietăților de radioprotecție asupra eritrocitelor. Probele de membrane eritrocitare rezultate în urma lizei eritrocitelor şi a îndepărtării conţinutului intracelular au fost analizate prin spectroscopie de THz. Rezultatele testelor au evidențiat că din punct de vedere al protecţiei faţă de efectul radiaţiei, derivatii de curcumina cu structură 3,5-bis(stiril)- pirazolonic manifesta proprietati de radioprotectie (P2, P7), dintre care compusul P2 este cel mai eficient.

În vederea testării eficienței radioprotecției derivaților de shogaol asupra eritrocitelor s-au efectuat analize biochimice. După iradierea cu radiaţie gamma doza de 50 Gy, activitatea GPx a eritocitelor tratate rămâne la acelaşi nivel cu cea a eritrocitelor tratate şi neiradiate, arătând că derivaţii de shogaol au prevenit o scădere adiţională a activităţii GPx datorată iradierii. Se evidenţiază astfel un efect radioprotectiv al derivaţilor de shogaol (Sh1 si Sh3).

Etapa 3 – 2022

Corelarea intensității efectului de radioprotecție și radiosensibilizare cu caracteristicile structurale ale compușilor selectați

După confirmarea proprietăților radioprotectoare/radiosensibilizatoare ale celor patru compuși derivați de curcumină (P2, P7) și shogaol (Sh1, Sh3), au fost stabiliți parametri optimi de sinteză pentru obținerea compușilor activi.

Tehnologia de obținere a derivaților curcuminici 3,5-bis(stiril)pirazolonic a fost prezentată prin stabilirea aparaturii de laborator și a materiilor prime utilizate în procesul de sinteză, etapele tehnologice și modul de lucru cu succesiunea de faze și operaţii care vor fi desfășurate.

În vederea elaborării modelului experimental demonstrativ s-a investigat activitatea fagocitică a granulocitelor din sângele uman folosind citometria în flux prin evaluarea exploziei oxidative după stimularea acestora cu Escherichia coli. Rezultatele obținute au arătat că, deși iradierea controlului a determinat scăderea numărului de granulocite pozitive, pre-incubarea cu derivații de curcumină a refăcut nivelul, la cel al controlului. În cazul derivaților de shogaol, nu au fost diferențe semnificative comparativ cu controlul neiradiat sau iradiat. Pentru stabilirea condițiilor de tratament s-au utilizat metode bioinformatice de predicţie a relaţei dintre structura celor 4 derivaţi radioprotectivi/radiosensibilizatori şi efectul biologic. In primul rând am verificat asemănarea dintre derivaţi şi moleculele de medicamente din punctul de vedere al proprietăţilor fizico-chimice. P2, Sh1 şi Sh7 se înscriu în intervalele optime specifice moleculelor de medicamente, în timp ce proprietăţile P7 se abat de la aceste intervale. Compuşii P2, Sh1 şi Sh3 apar ca biodisponibili pentru administrarea orală, sugerând că aceştia sunt capabili să circule până la locul unde vor exercita efectul biologic. P7 nu este biodisponibil, ceea ce sugerează că, în cazul său va fi necesară creşterea biodisponibilităţii eventual prin utilizarea unor mecanisme de livrare ţintită. Conform predicţiilor, compuşii se adsorb într-o proporţie foarte mare la nivelul intestinului subţire sau prin piele.

Tinand cont de aceste recomandari, compușii obținuți si validati ca avand proprietati radioprotectoare/ radiosensibilizatoare au fost condiționați sub formă de creme sau materiale hibride pentru livrare țintită și pot fi utilizați ca adjuvanți în radioterapie.

Figura 1: Compusul P2 (derivat de 2-fenil-3,5-bis(stiril)pirazol) condiționat ca emulsie a/u.

Figura 2: Nanocompozitul G718 (extract apos din ghimbir-SeNP) condiționat ca emulsie u/a.