ETAPA 1 .  – TESTE PRIVIND SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA ANTICORPILOR SINTETICI DE TIP NANOGEL (SNA)_S – OPTIMIZAREA SPECIFICITATII SI SELECTIVITATII NANOGELURILOR SNA

·      Act 1.1 –Funcționalizarea PEG având diferite mase moleculare (Mn =700÷2000 g/mol), prin reacție cu clorură de acriloil, precum și determinarea polidispersității PD, a masei moleculare medii numerice, Mn, și funcționalitate, F, macromonomerilor prin Cromatografie de lichide de inalta performanta (HPLC-SEC) și Rezonanța magnetică nucleară de proton.

·      Act 1.2 – Caracterizarea structurală a proteinei Spike S1 din punctul de vedere al potențialului Zeta, difracției cu raze X (XRD) și spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier (FTIR).

·      Act 1.3 – Partea 1 – Polimerizarea în mini-emulsie inversă (apă în ulei) a macromonomerilor funcționali PEGDA în prezența proteinei Spike S1 din coronavirus, în calitate de  templat.

·      Act 1.4 – Partea 1 – Dimensiunea, distribuția dimensiunii, potențialul Zeta și măsurarea indicelui de polidispersitate PDI pentru nanogelurile MIP-SNA fără ligand prin difuzie dinamică a luminii (DLS) și microscopie electronică cu transmisie/baleiaj (TEM/SEM).

·      Act 1.5 – Comunicarea și diseminarea rezultatelor.

REZUMAT EXECUTIV

SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) este un nou tip de coronavirus, responsabil de producerea bolii COVID-2019 la oameni, cu o rată de contagiune foarte ridicată în toată lumea. Până în prezent, la nivel global, COVID-19 a afectat peste 629,370,889 de persoane din întreaga lume, conducând la peste 6,578,245 de decese până la data de 8 noiembrie 2022. Scopul prezentului proiect constă în obtinerea de noi structuri de anticorpi sintetici de tip nanogel imprentate molecular (MIP-SNA) cu proteina Spike S1 (PSS1),  pe bază de macromonomeri de tipul polietilenglicoldiacrilat (PEGDA) care prezintă biocompatibilitate ridicată. În cadrul Etapei I/2022 au fost efectuate teste privind sinteza și caracterizarea anticorpilor sintetici de tip nanogel (SNA) imprentați molecular (MIP-SNA) cât și neimprentați molecular (NIP-SNA) cu PSS1, prin polimerizare în mini-emulsie inversă. Studiile experimentale la scară de laborator privind obținerea de SNA și analiza structurii și a compoziției caracteristice SNA au fost concentrate pe următoarele activități: (i) elaborarea studiilor privind condițiile de sinteză a macromerului pe bază de polietilenglicol (PEG) cu grupe terminale acrilat; (ii) caracterizarea fizico-chimică a PSS1; (iii) elaborarea studiilor privind condițiile de sinteză și caracterizarea SNA pe bază de polietilenglicol cu grupe terminale acrilat (PEGDA), în prezența PSS1 utilizată ca templat, prin polimerizare în mini-emulsie inversă.         

Caracterizarea fizico – chimică a macromerului pe bază de PEGDA, a PSS1 cât și a SNA,  s-a realizat utilizând tehnici avansate precum HPLC, FTIR, TGA/DTG, XRD, CD, DLS, SEM și TEM. Mai mult decât atât, caracterizarea PSS1 s-a realizat atât prin dicroism circular (CD), cât și prin difracție de raze X (XRD). Rezultatele XRD au evidențiat peak-uri cu distanțe mari de 183 și respectiv 152 Å, caracteristice interacțiunilor subunităților orientate aleator (random coil structure), aceste date fiind în concordanță cu rezultatele analizei CD. În ceea ce privește similitudinea dintre spectrele FTIR caracteristice NIP-SNA și a MIP-SNAext, s-a putut dovedi faptul că structura chimică a MIP-SNA nu a fost modificată în timpul procesului de imprentare (acest proces având la bază legături necovalente), fiind astfel confirmată îndepartare totală a PSS1 din MIP-SNA, în scopul obtinerii unor cavități complementare create artificial. Analizele TGA/DTG au confirmat prezența atât a macromonomerului cât și a proteinei/emulgatorilor în structura SNA în cazul MIP-SNA. Dimensiunea particulelor a putut fi analizată cu ajutorul tehnicii DLS, măsurătorile indicând dimensiuni în intervalul de 120-220 nm. Totodată, imaginile SEM au evidențiat structurile sferice, individuale ale particulelor sintetizate, iar micrografiile TEM obținute au indicat prezența structurii fibrilare amiloide a PSS1 absorbite pe nanoparticulele obținute. Rezultatul tuturor acestor studii experimentale, la scara de laborator, au condus la Stabilirea si Elaborarea Modelul Experimental (EM) privind obtinerea de anticorpi sintetici de tip nanogel (SNA).

            Gradul de realizarea a obiectivelor din cadrul Etapei 1/2022 a fost realizat în totalitate, iar obiectivele au fost îndeplinite în proporţie de peste 100%, rezultatele fiind în concordanță cu țintele propuse: 1 raport științific de activitate, 1 raport financiar și de audit; site-ul proiectului ANTISPIKE ; elaborarea modelului experimental (EM) de obţinere SNA; participarea la 5 conferinţe internaţionale si publicartea 1 Articol ISI (in zona rosie WoS, Q1, cu  date ce-au fost folosite ca punct de plecare și ca background al proiectului ANTISPIKE).

ETAPA 2  – OPTIMIZAREA SPECIFICITĂȚII ȘI REACTIVITĂȚII ÎNCRUCIȘATE A MIP-SNA FĂRĂ LIGAND PRINTR-UN PROCES DE FEED-BACK, PRECUM ȘI VERIFICAREA REPRODUCTIBILITĂȚII

OBIECTIVELE STUDIULUI DE CERCETARE

Studiul de cercetare a avut ca obiectiv principal optimizarea specificității și reactivității încrucișate a MIP-SNA fără ligand printr-un proces de feed back, precum și verificarea reproductibilității anticorpilor sintetici, de tip nanogel (SNA) pe bază de polietilenglicol cu grupe terminale acrilat (PEGDA), în prezența proteinei Spike S1, utilizată ca templat, prin polimerizare în mini-emulsie inversă. Alte obiective ale studiului au presupus:

Act 2.1 – Partea 2: Definitivarea studiilor privind polimerizarea în mini-emulsie inversa (apa în ulei) a macromonomerilor functionali PEGDA în prezenta proteinei Spike S1, utilizata ca templat.

Act 2.2 – Partea 2: Definitivarea studiilor privind dimensiunea, distributia marimii, potentialul Zeta si masurarea indicelui de polidispersitate PDI pentru

nanogelurile MIP-SNA fara ligand prin difuzie dinamica a luminii (DLS) si microscopie electronica cu transmisie/ de baleiaj (TEM/SEM).

Act. 2.3 – Folosind SNA sintetizate, se va determina specificitatea pentru proteina Spike S1. Analize preliminare privind evaluarea performantei SNA sintetizate. Aceasta activitate consta in teste de relegare ale proteinei Spike S1  în conditii statice pentru determinarea efectului de imprentare (evidentiat prin spectroscopie UV-VIS sau HPLC). Cuantificarea unor parametri importanti: concentratia de echilibru a proteinei Spike S1, Qe, capacitatea de adsorbtie a proteinei Spike S1, Q (g proteina Spike S1/g MIP-SNA) si factorul de imprentare, IF.

Act. 2.4 – Determinarea eficientei interactiunilor polimer-proteina cat si verificarea specificitatii anticorpilor sintetici de tip nanogel (SNAs) prin testul imunosorbant legat de enzima (ELISA), folosind anticorpi, ex: anticorp primar anti-Spike S1 si anticorp secundar, pentru a detecta si cuantifica retinerea si

legarea proteinei Spike S1.

Act 2.5. – Selectarea anticorpilor MIP-SNAs viabili dupa determinarea selectivitatii proteinei Spike S1 fata de Bat-CoV prin teste de imunoadsorbtie cu anticorpi marcati enzimatic (ELISA).

Act 2.6. – Sinteza MIP-SNA va fi reprodusa cu precizie conform retetei optime, in mai multe loturi.

Act. 2.7. – Reproductibilitatea MIP-SNA prin caracterizarea morfologica (TEM/SEM), dimensionala si determinarea indicelui de polidispersitate PDI (DLS).

Act 2.8 – Activitate de inovare si protejare a proprietatii intelectuale prin cerere de brevet.

Act 2.9 – Activitati de comunicare, redactarea/ trimiterea spre publicarea de lucrari stiintifice cu respectarea conditiilor de Open Access.

REZUMAT EXECUTIV

Răspândirea alarmantă a virusului SARS-CoV-2 a facut ca cercetătorii din intreaga lume sa-si indrepte cercetarile în căutarea unor metode terapeutice avansate ce pot preveni sau trata boala COVID-19 sau chiar actionand complementar tratamentelor medicamentoase clasice. Inspirându-se din răspunsul imunitar natural al organismului, o abordare interesanta in tratarea acestui virus letal a fost utilizarea polimerilor imprentati molecular (MIP) de tipul nanohidrogelurilor ce pot acționa ca un anticorp sintetic proiectat cu precizie pentru a recunoaște și a se lega de componente virale specifice. In ultimii ani, o creștere substanțială a numărului lucrărilor de specialitate subliniază potențialul MIP de a revoluționa tratamentele moderne pentru COVID-19. Studiul de cercetare din cadul Etapei II/2023 a avut ca obiectiv principal optimizarea specificității și reactivității încrucișate a MIP-SNA fără ligand printr-un proces de feed-back, precum și verificarea reproductibilității anticorpilor sintetici, de tip nanogel (SNA) pe bază de polietilenglicol cu grupe terminale acrilat (PEGDA), în prezența proteinei Spike S1, utilizată ca templat, prin polimerizare în mini-emulsie inversă. Astfel, s-a realizat definitivarea studiilor privind polimerizarea in mini-emulsie inversa a macromonomerilor functionali PEGDA in prezenta proteinei Spike S1 (PSS1) din coronavirus ca templat. S-a avut in vedere si definitivarea investigatiilor privind atat dimensiunea, distributia marimii si masurarea indicelui de polidispersitate prin tehnica DLS cat si evidentierea caracteristicilor morfologice prin SEM si a caracteristicilor fizico-chimice prin FTIR si TGA/DTG pentru nanogelurile MIP/NIP-SNA. Măsurătorile DLS au evidențiat faptul că nanogelurile neimprentate (NIP-SNA) și cele imprentate obținute după procesul de spălare (MIP-SNA_ext) au prezentat dimensiuni similare de aproximativ 150-220 nm, iar nanogelurile imprentate MIP-SNA au prezentat dimensiuni mai mari de aproximativ 250 nm indicând astfel, prezența proteinei Spike S1 în structura nanoparticulelor. Imaginile SEM obținute au evidențiat o forma sferica bine definită a particulelor, dar și prezența mai multor populații de diferite dimensiuni așa cum s-a putut observa și în cadrul analizei DLS. Studiul s-a continuat prin determinarea eficientei interactiunilor polimer-proteina si verificarea specificitatii anticorpilor sintetici SNA prin gel-electroforeza, metode spectrofotometrice (metoda Bradford,) dar si prin testul imunosorbant legat de enzima (ELISA) folosind anticorpi precum anticorp primar anti-Spike S1 si anticorp secundar. Capacitatiile de adsorbtie si efectul de imprentare caracteristice MIP-SNA sintetizati au fost determinate in cadrul testelor de specificitate pentru PSS1, efectuate in duplicat, unde s-au observat o valoare ridicata a factorului de imprentare (IF), de 12.8 cu o eficienta de adsorbtie de 8% si 15.9 cu eficienta de adsorbtie de 10%. De asemenea, determinarea eficientei interactiunilor polimer-proteina a fost pusa in evidenta cu ajutorul spectroscopia circulară de dicroism, unde rezultatele au dovedit faptul că structura secundara a PSS1 nu a fost modificată sau denaturata în timpul procesului de imprentare, acest proces avand la baza legaturi necovalente. Verificarea specificitatii anticorpilor sintetici de tip nanogel (SNA) a fost evidentiata prin testul imunosorbant legat de enzima (ELISA), unde rezultatele au prezentat o concentratie de adsorbtie semificativa mai mare fata de PSS1 (59.89%) in raport cu concentratia de adsorbtie fata de BatCoV (29.62%), indicand o adsorbtie preferentiala/selectiva pentru PSS1 din SARSC-CoV-2 relativ cu BatCoV.  Reproductibilitatea MIP-SNA a constat in reproducerea cu precizie a procesului de sinteza a MIP-SNA conform retetei optime, in mai multe loturi, dar si prin caracterizarea morfologica si dimensionala atat a MIP-SNA cat si a NIP–SNA sintetizate, rezultatele confirmand reproductibilitatea analizelor. Aceste rezultate incurajaza ipoteza utilizarii acestor sisteme în scopul creării de noi structuri de anticorpi sintetici de tip nanogeluri imprentate molecular pentru recunoașterea și retentia de proteina SPIKE S1 din SARS-CoV-2, facand astfel posibila blocarea procesului de fuziune intre membranele celulelor virale SARS-CoV-2 cu cele ale celulei gazdă.  Astfel, conceptul propus este destinat recunoasteri si retentiei de PSS1, prin intermediul nanogelurilor imprentate molecular, si va reprezenta o soluție complet originală în domeniul nanobiomedicinei.

Gradul de realizarea a obiectivelor din cadrul Etapei II/2023 a fost realizat în totalitate, iar obiectivele au fost îndeplinite în proporţie de 100%, rezultatele fiind în concordanță cu țintele propuse: 1 raport științific de activitate, 1 raport financiar și de audit; site-ul proiectului ANTISPIKE ; elaborarea modelului functional (EF) de obţinere SNA; participarea la 4 conferinţe internaţionale si publicartea 1 Articol ISI (in zona rosie WoS, Q1).

DISEMINARE

Pe lângă Elaborarea Modelului Functional privind obținerea de anticorpi sintetici de tip nanogel (SNA) imprentati molecular (MIP-SNA) cu proteina Spike S1, proiectul are si o puternica componentă de diseminare a rezultatelor. Astfel, metode de obtinere a unor structuri de hidrogeluri pe baza de PEGDA, si metode de caracterizarea a hidrogelurilor au fost folosite ca backround al proiectului ANTISPIKE Nr. 144/2022, si au fost diseminate prin: (i). depunerea unei cereri de brevet la OSIM cu Nr. A 2023- 00717/21.10.2023 (ii). publicarea unui articol ȋn revista Pharmaceutics (in zona rosie WoS, Q1), cu FI =5.4, si (ii). participarea la 4 manifestări stiinţifice international (2 prezentări orale si 2 ca poster).

1 Cerere nationala de brevet: Zaharia Anamaria, Neblea Elena Iulia, Sarbu Andrei, Iordache Tanta Verona, Chiriac Anita Laura, Gavrila Ana Mihaela, Sandu Teodor, Stoica Elena Bianca, Dumitru Marinela- Victoria, Miron Andreea, Dolana Sorin Viorel, Neagu Ana Lorena, Nanogeluri imprentate molecular  cu comportament biomimetic de anticorpi pentru recunoasterea moleculara a proteinei Spike S1 din virusul SARS COV 2 si procedeu de obtinere a nanogelurilor A 2023- 00717/21.10.2023, (TE144/2022 si 15PFE/2023).

1 Articol ISI Publicat: Ana-Loren Neagu, Anamaria Zaharia, Octavian Dumitru Pavel, Alina Tirsoaga, Iulia Elena Neblea, Sorin Viorel Dolana, Carmen Elena Țebrencu, Tanta-Verona Iordache, Andrei Sarbu, Rodica Zavoianu, Synergistic Sustained Drug Release System based on immobilized Rhamnus Frangula L phytoextract into Layered Double Hydroxide covered by Biocompatible Hydrogel, Pharmaceutics, 2023, 15(7), 1888; https://doi.org/10.3390/pharmaceutics15071888 (646PED, 144TE) (IF=5.4)

4 Manifestari Stiintifice: 1. Exploratory Workshop Next Chem V ed. Bucuresti, 22-23 May 2023, 5th edition, Bucharest, Romania, Iulia Elena NEBLEA, Anamaria ZAHARIA, Tanța-Verona IORDACHE, Anita Laura Chiriac, Ana-Mihaela GAVRILĂ, Sorin Viorel DOLANA, Andreea MIRON, Ana-Lorena NEAGU, Mircea TEODORESCU, François-Xavier PERRIN, Molecularly Imprinted Nanogels for Spike S1 Protein Recognition (15PFE, 144TE);

 2. 3rd International Conference on Bioengineering and Polymer Science, Bucharest, June 7-11, 2023 ROMANIA; Anamaria Zaharia, Ana Lorena Neagu, Octavian Dumitru Pavel, Alina Tîrşoaga, Iulia Elena Neblea, Sorin Viorel Dolana, Tanţa Verona Iordache, Rodica Zăvoianu, Andrei Sârbu, Layered Double Hydroxides – Polyethylene Glycol Diacrylate Composite Hydrogels for the Controlled Release of Rhamnus Frangula L Phytoextract, (144TE si 646PED, AQUAMAT);

3. PRIORITIES OF CHEMISTRY FOR A SUSTAINABLE DEVELOPMENT PRIOCHEM – XIXth Edition, 11-13 octombrie 2023; Bucharest; Ana-Lorena Neagu, Anamaria Zaharia, Marinela Victoria Dumitru, Iulia Elena Neblea, Sorin Dolana, Tanta Verona Iordache, Carmen Elena Tebrencu, Rodica Zavoianu, Octavian Dumitru Pavel, Alina Tîrsoaga, Andrei Sarbu, Drug-Release System Based on Biocompatible Hydrogel Charged With Layered Double Hydroxide Containing Encapsulated Rhamnus Frangula L. Phytoextract, prez. Orala (646PED; 144TE);

4. 5th Euro-Mediterranean Conference for Environmental Integration (EMCEI-2023), 2-5 octombrie 2023, Anamaria Zaharia, Iulia Elena Neblea, Anita -Laura Chiriac, Ana-Mihaela Gavrila, Sorin Dolana, Ana Lorena Neagu, Bogdan Trica, Andrei Sarbu, Francois-Xavier Perrin, Tanta-Verona Iordache